實(shí)驗(yàn)前該準(zhǔn)備哪些試劑?怎么配制實(shí)驗(yàn)試劑?實(shí)驗(yàn)前該準(zhǔn)備哪些儀器?怎么培養(yǎng)海馬神經(jīng)元?怎么觀(guān)察神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)?怎么鑒定神經(jīng)元?怎么培養(yǎng)小鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元?怎么培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞?怎么培養(yǎng)原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞?怎么測(cè)定小膠質(zhì)細(xì)胞趨化、遷移、吞噬功能?怎么測(cè)試實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的學(xué)習(xí)和記憶?怎么檢測(cè)基因芯片?怎么做神經(jīng)免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色?怎么應(yīng)用Image J 神經(jīng)生物分析軟件、GraphPad Prism 6.0軟件、SPSS軟件?……本書(shū)圖文結(jié)合予一一介紹。實(shí)驗(yàn)流程嚴(yán)格按照美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH)、國(guó)立老化研究所(NIA)的標(biāo)準(zhǔn)、規(guī)范執(zhí)行。內(nèi)容實(shí)用,具有可操作性。
本書(shū)適合從事神經(jīng)病學(xué)研究的人員,如神經(jīng)內(nèi)科、神經(jīng)外科醫(yī)師、研究生、醫(yī)學(xué)院;A(chǔ)研究人員,特別適合初學(xué)者閱讀參考。
實(shí)驗(yàn)流程嚴(yán)格按照美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH)、國(guó)立老化研究所(NIA)的標(biāo)準(zhǔn)、規(guī)范執(zhí)行,包括實(shí)驗(yàn)技術(shù)的概述,材料準(zhǔn)備、操作步驟、操作指導(dǎo)、思考、注意事項(xiàng)(包括實(shí)驗(yàn)結(jié)果不是想要的時(shí)的應(yīng)急預(yù)案)、失敗的經(jīng)驗(yàn)或成功的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)等,圖文結(jié)合介紹Image J 神經(jīng)生物分析軟件、GraphPad Prism 6.0軟件、SPSS軟件的應(yīng)用按本書(shū)的指導(dǎo),可以提高實(shí)驗(yàn)效率,分析統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
神經(jīng)變性疾病(Neurodegenerative Diseases)是一類(lèi)由于腦和(或)脊髓神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能漸進(jìn)性退變、缺失所導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)疾病,包括阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化等。隨著全球社會(huì)人口老齡化進(jìn)程加速,神經(jīng)變性疾病患病人數(shù)逐年上升,已不再是少見(jiàn)病。神經(jīng)變性疾病的早期診斷與識(shí)別困難,目前尚無(wú)有效的根治手段,加強(qiáng)其病因和發(fā)病機(jī)制研究成為國(guó)際神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。除了年齡老化外,遺傳和環(huán)境因素也是本類(lèi)疾病的主要致病因素。神經(jīng)變性疾病以運(yùn)動(dòng)功能和認(rèn)知功能障礙為主要臨床表現(xiàn),組織病理學(xué)顯示特定部位神經(jīng)元緩慢漸進(jìn)性丟失,并大多在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)蛋白質(zhì)異常聚集、形成包涵體。此類(lèi)疾病可能具有相似的發(fā)病機(jī)制,包括:蛋白的錯(cuò)誤折疊;細(xì)胞器中蛋白降解紊亂,線(xiàn)粒體功能障礙,軸突轉(zhuǎn)運(yùn)異常;細(xì)胞程序性死亡(凋亡、自噬);線(xiàn)粒體DNA突變和氧化應(yīng)激等。
2013年我得到醫(yī)院公派出國(guó)留學(xué)的機(jī)會(huì),有幸來(lái)到世界著名的美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH)、美國(guó)國(guó)家衰老研究所(NIA)進(jìn)修學(xué)習(xí)。這里有二十幾個(gè)研究機(jī)構(gòu),匯集了全世界的科學(xué)精英從事醫(yī)學(xué)科學(xué)研究。之前我雖是個(gè)神經(jīng)內(nèi)科大夫,但始終無(wú)法忘卻在攻讀碩士、博士研究生期間從事神經(jīng)科學(xué)實(shí)驗(yàn)過(guò)程所經(jīng)歷的痛楚和樂(lè)趣。原以為自己掌握了許多神經(jīng)生物學(xué)的基本實(shí)驗(yàn)技能,但來(lái)到NIH之后才知道國(guó)內(nèi)與這邊的差距。NIH的神經(jīng)科學(xué)家們做實(shí)驗(yàn)的規(guī)范程度和完成實(shí)驗(yàn)的效率讓我驚嘆不已!我認(rèn)為這些很大一部分歸功于規(guī)范的實(shí)驗(yàn)操作流程和有序的分工協(xié)作。有感而發(fā),心中萌動(dòng)編寫(xiě)一部規(guī)范、實(shí)用的神經(jīng)變性疾病相關(guān)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)操作和方法的手冊(cè)。于是乎,盡我所能,盡力在NIH把標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范的實(shí)驗(yàn)流程一一學(xué)到,每項(xiàng)親自操作,并由此將所學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)歷和經(jīng)驗(yàn)融匯記載于書(shū)中,一來(lái)作為督促自己學(xué)習(xí)的動(dòng)力,二來(lái)將其中的經(jīng)驗(yàn)與其他學(xué)者分享。但更為重要的是,本書(shū)的編寫(xiě)旨在幫助國(guó)內(nèi)從事或感興趣神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域的研究人員(尤其是初學(xué)者)在實(shí)驗(yàn)操作方面盡可能少走些彎路,提高一些實(shí)驗(yàn)效率,多一點(diǎn)時(shí)間去觀(guān)察和發(fā)現(xiàn)真實(shí)的、新的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象,多一些時(shí)間去思考實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、訓(xùn)練自己的科研思維,并碰撞出更多、更富有創(chuàng)新意義的思想火花。
同時(shí),本書(shū)編寫(xiě)包含了神經(jīng)變性疾病臨床數(shù)據(jù)登記體例和數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)要點(diǎn),并介紹了本單位團(tuán)隊(duì)自主研發(fā)的神經(jīng)心理認(rèn)知測(cè)試系統(tǒng)及其應(yīng)用,以及我們?cè)谂R床和基礎(chǔ)科研過(guò)程中十分常用的圖像和數(shù)據(jù)處理軟件,如Image J、GraphPad Prism、SPSS的應(yīng)用范式、Endnote文獻(xiàn)編輯等。相信,無(wú)論是從事神經(jīng)病學(xué)的臨床還是基礎(chǔ)科研人員都能從本書(shū)中獲得許多十分有用的幫助。
本書(shū)的編寫(xiě)過(guò)程得到福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院陳曉春教授、黃品華教授提出的寶貴意見(jiàn)。同時(shí)由衷感謝美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH)、美國(guó)國(guó)立老化研究院(NIA)蔡懷彬高級(jí)研究員及其所在實(shí)驗(yàn)室成員在我在NIH學(xué)習(xí)期間對(duì)我實(shí)驗(yàn)技術(shù)的悉心傳授,以及感謝他們?cè)诰帉?xiě)本書(shū)過(guò)程中提供的寶貴意見(jiàn)。
本書(shū)由國(guó)家自然科學(xué)基金(項(xiàng)目號(hào):81200991及81571257)、福建省高校新世紀(jì)人才支持計(jì)劃(項(xiàng)目號(hào):JA13131)、福建省衛(wèi)生系統(tǒng)中青年骨干人才培養(yǎng)項(xiàng)目資助計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(項(xiàng)目號(hào):2014-ZQN-ZD-11)、福建省自然科學(xué)基金(面上聯(lián)合)(項(xiàng)目號(hào):2015J01398)以及國(guó)家臨床重點(diǎn)專(zhuān)科老年病科建設(shè)項(xiàng)目、福建省臨床重點(diǎn)專(zhuān)科老年醫(yī)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目聯(lián)合資助出版。
潘曉東
福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科
福建省老年醫(yī)學(xué)研究所
福建省分子神經(jīng)病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室
2016年6月22日于福州
潘曉東,副主任醫(yī)師,醫(yī)學(xué)博士,碩士生導(dǎo)師。福建省醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)秘書(shū)及青年委員,第九屆中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)師大會(huì)華南分會(huì)秘書(shū)。長(zhǎng)期從事神經(jīng)病學(xué)的臨床、教學(xué)、科研工作。曾赴美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH)/國(guó)立老化研究所(NIA)研修1年。專(zhuān)業(yè)特長(zhǎng):阿爾茨海默病、帕金森病等老年神經(jīng)變性疾病的診治,尤其對(duì)各種癡呆性疾病的鑒別診斷及治療具有豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)。近年承擔(dān)多項(xiàng)國(guó)家層面及省級(jí)科研課題,發(fā)表SCI源及核心期刊論文10余篇,主編專(zhuān)著1部。曾獲“福建青年科技獎(jiǎng)”及“福建運(yùn)盛青年科技獎(jiǎng)”榮譽(yù)。
第一章 原代神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞功能測(cè)定 / 1
第一節(jié) 原代皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元培養(yǎng) 1
第二節(jié) 新生小鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元培養(yǎng) 3
一、單層皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞表面培養(yǎng)新生鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元 3
二、單層星形膠質(zhì)細(xì)胞表面培養(yǎng)新生鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元及形成
神經(jīng)突觸 9
三、本節(jié)實(shí)驗(yàn)中使用到的試劑和溶液 11
四、注意事項(xiàng) 13
五、常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案 13
六、預(yù)期結(jié)果 13
七、時(shí)間因素 14
第三節(jié) 小鼠神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng) 14
一、成年鼠神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng) 14
二、新生鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng) 19
三、胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng) 20
第四節(jié) 原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng) 21
一、星形膠質(zhì)細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 21
二、新生鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng) 23
三、成年鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 25
第五節(jié) 小膠質(zhì)細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn) 29
一、趨化和遷移實(shí)驗(yàn) 29
二、體外測(cè)定小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬功能(吞噬尼羅紅微球/a突觸核蛋白/Ab) 30
第二章 模式動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn) / 34
第一節(jié) Morris水迷宮 34
第二節(jié) Y-迷宮 36
第三節(jié) 小鼠平衡功能實(shí)驗(yàn) 39
第四節(jié) 抑郁模型的建立和評(píng)定 40
一、抑郁癥的模型制作 41
二、抑郁動(dòng)物的行為學(xué)評(píng)價(jià) 45
第五節(jié) 嗅覺(jué)行為功能測(cè)定 47
一、埋藏食物小球?qū)嶒?yàn) 48
二、嗅覺(jué)迷宮 48
第六節(jié) 大腦中動(dòng)脈閉塞模型的建立和評(píng)定 49
第七節(jié) 運(yùn)動(dòng)功能評(píng)定 52
一、小鼠肢體力量測(cè)試實(shí)驗(yàn)——小鼠抓力測(cè)試 52
二、小鼠耐力測(cè)試實(shí)驗(yàn)——跑臺(tái)實(shí)驗(yàn) 53
第八節(jié) 感覺(jué)(痛觸覺(jué))系統(tǒng)評(píng)估 54
一、Von Frey Test 54
二、智能熱板儀 56
三、甩尾實(shí)驗(yàn) 57
第三章 神經(jīng)病理學(xué)實(shí)驗(yàn) / 59
第一節(jié) 腦組織的取材、保存和標(biāo)本制作 59
第二節(jié) 脊髓組織的取材、保存和標(biāo)本制作 62
一、脊髓的取材和保存 62
二、 脊髓冰凍切片的制作 64
第三節(jié) 小鼠腦脊液采集 66
第四節(jié) 海馬腦片場(chǎng)電位的神經(jīng)電生理記錄方法 67
第五節(jié) 神經(jīng)免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色 71
第六節(jié) 透視電鏡標(biāo)本制作 74
第七節(jié) 老化組織相關(guān)病理特殊染色(SA-b-gal 、銀染色) 77
一、神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFTs)染色 77
二、b-淀粉樣蛋白染色 80
三、衰老相關(guān)b-半乳糖苷酶染色 82
第八節(jié) 神經(jīng)組織高爾基染色 83
第九節(jié) 神經(jīng)組織體視學(xué)分析技術(shù) 86
第十節(jié) 共聚焦掃描及定量技術(shù) 92
一、激光共聚焦顯微鏡的成像原理 92
二、激光共聚焦顯微鏡在神經(jīng)變性疾病研究中的運(yùn)用 93
三、激光共聚焦顯微鏡結(jié)構(gòu) 95
四、基本掃描及圖像獲取 95
五、微分干涉差(DIC)掃描及圖像獲取 102
六、拼圖掃描及圖像獲取 103
七、Z-Stack掃描及圖像獲取 103
八、時(shí)間序列掃描 105
九、激光共聚焦圖像定量及后處理 106
第四章 神經(jīng)生化和基因檢測(cè) / 115
第一節(jié) 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基因型鑒定、保種和管理 115
一、小鼠生殖生理 115
二、小鼠的生長(zhǎng)周期 116
三、基因工程鼠飼養(yǎng)繁殖一般流程和注意事項(xiàng) 116
四、常用小鼠品系的概況 117
五、幾種常用神經(jīng)變性疾病轉(zhuǎn)基因鼠的介紹和鑒定 118
第二節(jié) 神經(jīng)組織蛋白檢測(cè) 125
一、蛋白質(zhì)印跡法 125
二、免疫共沉淀原理及步驟 130
三、動(dòng)物腦組織勻漿檢測(cè)Ab 132
第三節(jié) RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù) 134
一、RNA提取 134
二、RT-PCR 135
三、qPCR 135
第四節(jié) 基因芯片檢測(cè) 140
一、單核苷酸多態(tài)性芯片實(shí)驗(yàn) 140
二、基因表達(dá)譜芯片檢測(cè) 142
第五節(jié) 熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)分析啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性 143
第六節(jié) 熒光定量PCR法檢測(cè)端粒酶活性 146
第七節(jié) 中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸和非突觸線(xiàn)粒體的分離提取 148
第五章 分子影像技術(shù)檢測(cè)神經(jīng)變性疾病 / 157
第一節(jié) PET/SPECT-CT顯像探針的制備 158
第二節(jié) fMRI成像技術(shù)的原理及其實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理 164
一、fMRI實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 164
二、實(shí)驗(yàn)設(shè)備 166
三、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理 166
四、fMRI實(shí)驗(yàn)相關(guān)的準(zhǔn)備 169
五、小結(jié) 170
第六章 神經(jīng)變性疾病患者臨床神經(jīng)評(píng)估、樣本保存和數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè) / 171
第一節(jié) 神經(jīng)變性疾病臨床登記和數(shù)據(jù)庫(kù)建立和實(shí)施 171
一、臨床研究目標(biāo)的確立 171
二、研究方案的確立 172
三、組織機(jī)構(gòu)的建立 173
四、病例報(bào)告表(CRF)的建立 174
第二節(jié) 神經(jīng)變性疾病患者血液、腦脊液組織樣本的保存和處理 177
一、血液及血液成分的處理和保存 178
二、腦脊液的處理和保存 179
三、標(biāo)本DNA的提取和保存 180
附表6-1 標(biāo)本保存詳細(xì)記錄 180
附表6-2 關(guān)于使用組織樣本開(kāi)展科學(xué)研究的知情同意書(shū) 181
第三節(jié) 神經(jīng)心理認(rèn)知障礙測(cè)試診斷系統(tǒng) 182
一、醫(yī)生端系統(tǒng) 182
二、用戶(hù)管理 183
三、臨床病例登記 183
四、案例管理 186
五、統(tǒng)計(jì)打印 190
六、量表管理 191
第七章 神經(jīng)生物學(xué)常用分析及作圖軟件的應(yīng)用 / 193
第一節(jié) Image J神經(jīng)生物分析軟件的應(yīng)用 193
一、 Image J神經(jīng)生物分析軟件的基本功能 193
二、 Image J神經(jīng)生物分析軟件分析免疫熒光定量技術(shù) 197
第二節(jié) Graphpad Prism 6.0作圖和統(tǒng)計(jì)應(yīng)用 205
一、折線(xiàn)圖 205
二、直條圖 208
三、生存曲線(xiàn)圖 216
四、散點(diǎn)圖 219
五、餅圖 225
第三節(jié) Logistic回歸、Cox風(fēng)險(xiǎn)模型以及Kaplan-Meier曲線(xiàn)的統(tǒng)計(jì)應(yīng)用 231
一、Logistic回歸分析和ROC工作曲線(xiàn)的制訂 231
二、 Cox回歸分析 238
三、Kaplan-Meier曲線(xiàn)分析 242
第四節(jié) EndNote×7的應(yīng)用 245
一、文獻(xiàn)管理 245
二、論文撰寫(xiě) 245