本書為高等學(xué)校生物技術(shù)與生物工程專業(yè)課程iCourse 教材，系統(tǒng)介紹了細(xì)胞工程基礎(chǔ)、原理、關(guān)鍵技術(shù)及其應(yīng)用，以及本領(lǐng)域的最新研究成果，突出細(xì)胞工程在解決相關(guān)重大理論問(wèn)題及其實(shí)踐應(yīng)用方面的特色。全書分為13 章，前3 章主要介紹細(xì)胞工程的發(fā)展簡(jiǎn)史、理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)；第4 章至第7 章主要介紹細(xì)胞工程關(guān)鍵技術(shù)；第9 至第13 章主要介紹細(xì)胞工程應(yīng)用實(shí)踐。本書各章既獨(dú)立成章、又相互聯(lián)系，內(nèi)容安排相互銜接，既強(qiáng)調(diào)系統(tǒng)性和基礎(chǔ)性，又緊扣應(yīng)用實(shí)踐。
細(xì)胞工程是現(xiàn)代生物技術(shù)與生物工程的重要組成部分，是細(xì)胞生物學(xué)與發(fā)育生物學(xué)和遺傳學(xué)的交叉領(lǐng)域，無(wú)論在生命科學(xué)基礎(chǔ)研究方面還是在生物高科技產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域，都已取得舉世矚目的成就，并取得了顯著的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。細(xì)胞工程已成為高等院校生物技術(shù)、生物工程及相關(guān)專業(yè)的主修課程，也是農(nóng)學(xué)、醫(yī)藥等相關(guān)專業(yè)的重要課程。細(xì)胞工程所涉及的主要技術(shù)領(lǐng)域有細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞融合、細(xì)胞拆合、染色體操作及基因轉(zhuǎn)移等諸多方面，其理論知識(shí)寬厚，應(yīng)用十分廣泛。近年來(lái)，隨著互聯(lián)網(wǎng)發(fā)展，教育信息化和國(guó)際化日益凸顯，學(xué)生的學(xué)習(xí)方式發(fā)生了悄然改變，原有教學(xué)方式受到越來(lái)越大的挑戰(zhàn)，需要積極探索適應(yīng)學(xué)生學(xué)習(xí)方式轉(zhuǎn)變的新型教育教學(xué)方式方法。慕課（Massive Open On line Course，MOOC，大規(guī)模開(kāi)放在線課程）順應(yīng)時(shí)代發(fā)展應(yīng)運(yùn)而生，同時(shí)，翻轉(zhuǎn)課堂、混合課堂等新的教學(xué)模式探索逐漸普及。在新的教學(xué)模式中，教師角色由講授者轉(zhuǎn)變?yōu)檎n程電子資源建設(shè)者和提供者，以及教學(xué)過(guò)程的引導(dǎo)者、啟發(fā)者，充分體現(xiàn)了“以學(xué)生為中心”的學(xué)習(xí)者主體地位，極大促進(jìn)了學(xué)生自主學(xué)習(xí)、主動(dòng)探索和創(chuàng)新思維能力的培養(yǎng)。為了進(jìn)一步提高教學(xué)效果和質(zhì)量，必須建設(shè)與此相適應(yīng)的新形態(tài)教材，幫助學(xué)生盡快適應(yīng)新的教學(xué)方式。本書正是順應(yīng)這一發(fā)展需要編寫的新形態(tài)教材，紙質(zhì)教材與數(shù)字課程一體化設(shè)計(jì)：紙質(zhì)教材設(shè)置了知識(shí)導(dǎo)圖、主干內(nèi)容、思考題和開(kāi)放討論題等內(nèi)容；數(shù)字課程提供了與紙質(zhì)教材配套的知識(shí)拓展、深入學(xué)習(xí)、應(yīng)用案例、視頻、動(dòng)畫、本章小結(jié)、教學(xué)課件、自測(cè)題、參考文獻(xiàn)等資源。這種教材構(gòu)架方式，一方面可以幫助學(xué)生更好地理解并掌握知識(shí)點(diǎn)，另一方面可以幫助學(xué)生重構(gòu)學(xué)習(xí)方式，引導(dǎo)學(xué)生自主學(xué)習(xí)和探索，同時(shí)給予學(xué)生更大的自主選擇權(quán)。
本書系統(tǒng)介紹了細(xì)胞工程基本原理、關(guān)鍵技術(shù)及其應(yīng)用實(shí)踐，以及本領(lǐng)域的最新研究成果，突出細(xì)胞工程在解決重大理論問(wèn)題及應(yīng)用實(shí)踐方面的特色。各章節(jié)由在該領(lǐng)域長(zhǎng)期進(jìn)行研究的學(xué)者編著，很好地反映了該領(lǐng)域的研究進(jìn)展。全書分為13章，前3章主要介紹細(xì)胞工程的發(fā)展簡(jiǎn)史、理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)；第4至7章主要介紹細(xì)胞工程關(guān)鍵技術(shù)；第8至13章主要介紹細(xì)胞工程的應(yīng)用實(shí)踐。本書各章既相對(duì)獨(dú)立、又相互聯(lián)系，內(nèi)容安排相互銜接，既強(qiáng)調(diào)系統(tǒng)性和基礎(chǔ)性，又緊扣應(yīng)用實(shí)踐。通過(guò)本教材的學(xué)習(xí)，學(xué)生可全面掌握細(xì)胞工程的原理和關(guān)鍵技術(shù)，并熟悉細(xì)胞工程的應(yīng)用實(shí)踐，為學(xué)生今后的發(fā)展打下良好的理論和技術(shù)基礎(chǔ)。此外，本書按照研究的思路提出科學(xué)問(wèn)題，并采用各種技術(shù)手段來(lái)求證，并在此基礎(chǔ)上提出新的問(wèn)題，邏輯性強(qiáng)。本書可供高等院校生物技術(shù)、生物工程及相關(guān)專業(yè)的本科生和研究生使用，也可作為科研工作者參考書。
本書由余龍江教授（華中科技大學(xué)）擔(dān)任主編，鄧寧教授（暨南大學(xué)）、李青旺教授（西北農(nóng)林科技大學(xué)）、付春華副教授（華中科技大學(xué)）擔(dān)任副主編。華中科技大學(xué)的陳明潔、敖明章和楊英副教授，河北大學(xué)康現(xiàn)江教授，吉林大學(xué)單亞明教授和黃宜兵副教授，暨南大學(xué)唐勇教授和王永飛副教授，中國(guó)科學(xué)院武漢植物園章焰生研究員，西北農(nóng)林科技大學(xué)江中良和孫秀柱副教授，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)趙蕊副教授等老師參與了教材編寫。付春華、余龍江對(duì)書稿進(jìn)行了全面統(tǒng)稿和核校。同時(shí)，華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院的董艷山、張蒙、王碩、聶琳、戴露丹等研究生參與核校了部分書稿，付出了辛勤勞動(dòng)。本書出版得到了高等教育出版社的大力支持和全力合作。在此一并表示誠(chéng)摯謝意。
由于本書涉及的知識(shí)面較廣，而且該領(lǐng)域及相關(guān)學(xué)科發(fā)展很快，加之時(shí)間緊、任務(wù)重，編者業(yè)務(wù)水平有限，書中難免存在不足甚至瑕疵，敬請(qǐng)讀者不吝賜教，以便及時(shí)更正和完善。
編者
2016年8月
1 緒論
1．1 細(xì)胞工程概述
1．1．1 細(xì)胞工程概念
1．1．2 細(xì)胞工程基本內(nèi)容
1．2 細(xì)胞工程發(fā)展簡(jiǎn)史
1．2．1 探索期
1．2．2 奠基期
1．2．3 蓬勃發(fā)展期
1．3 細(xì)胞工程發(fā)展前景
1．3．1 細(xì)胞工程理論發(fā)展前景
1．3．2 細(xì)胞工程技術(shù)發(fā)展前景
1．3．3 細(xì)胞工程應(yīng)用前景
1．4 細(xì)胞工程學(xué)習(xí)方法
2 細(xì)胞工程理論基礎(chǔ)
2．1 細(xì)胞全能性
2．1．1 細(xì)胞全能性定義
2．1．2 細(xì)胞全能性研究歷史
2．1．3 細(xì)胞全能性應(yīng)用
2．2 細(xì)胞分化與脫分化
2．2．1 細(xì)胞分化
2．2．2 細(xì)胞脫分化
2．3 細(xì)胞融合
2．3．1 細(xì)胞融合的概念
2．3．2 細(xì)胞融合的基本原理
2．4 合成生物學(xué)與人工細(xì)胞
2．4．1 合成生物學(xué)概述
2．4．2 合成生物學(xué)關(guān)鍵技術(shù)
2．4．3 人工細(xì)胞
3 細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)
3．1 細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室的規(guī)劃設(shè)計(jì)及常用儀器設(shè)備
3．1．1 基本實(shí)驗(yàn)室
3．1．2 輔助實(shí)驗(yàn)室
3．2 無(wú)菌操作技術(shù)
3．2．1 培養(yǎng)用品的清洗
3．2．2 滅菌原理與方法
3．2．3 無(wú)菌操作技術(shù)
3．2．4 無(wú)菌操作技術(shù)的注意事項(xiàng)
3．2．5 污染的檢測(cè)與控制
3．3 培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)與優(yōu)化
3．3．1 植物細(xì)胞培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)與優(yōu)化
3．3．2 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)與優(yōu)化
4 細(xì)胞組織培養(yǎng)技術(shù)
4．1 植物細(xì)胞組織及器官培養(yǎng)技術(shù)
4．1．1 植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)
4．1．2 植物器官培養(yǎng)
4．1．3 植物細(xì)胞組織開(kāi)放式培養(yǎng)
4．2 動(dòng)物細(xì)胞組織及器官培養(yǎng)技術(shù)
4．2．1 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)
4．2．2 動(dòng)物組織培養(yǎng)
4．2．3 動(dòng)物器官培養(yǎng)
5 細(xì)胞融合技術(shù)
5．1 細(xì)胞融合技術(shù)概述
5．1．1 細(xì)胞融合方法
5．1．2 融合細(xì)胞的篩選
5．2 細(xì)胞融合技術(shù)發(fā)展歷程
5．3 動(dòng)物細(xì)胞融合——雜交瘤技術(shù)
5．3．1 雜交瘤技術(shù)概述
5．3．2 單克隆抗體制備基本原理
5．3．3 單克隆抗體制備基本流程
5．3．4 雜交瘤細(xì)胞的篩選
5．3．5 單克隆抗體細(xì)胞株的建立
5．4 植物細(xì)胞融合技術(shù)
5．4．1 植物原生質(zhì)體制備
5．4．2 植物原生質(zhì)體培養(yǎng)
5．4．3 植物原生質(zhì)體融合
5．4．4 植物體細(xì)胞雜種植株的鑒定
6 細(xì)胞拆合與克隆技術(shù)
6．1 細(xì)胞拆合
6．1．1 細(xì)胞拆合技術(shù)發(fā)展概況
6．1．2 細(xì)胞拆合技術(shù)：
6．1．3 細(xì)胞器重組
6．1．4 轉(zhuǎn)染色體核移植技術(shù)
6．2 克隆技術(shù)
6．2．1 克隆的概念和分類
6．2．2 克隆技術(shù)研究進(jìn)展
6．2．3 胚胎分割技術(shù)
6．2．4 哺乳動(dòng)物克隆
7 干細(xì)胞技術(shù)
7．1 干細(xì)胞概述
7．1．1 干細(xì)胞定義
7．1．2 干細(xì)胞分類
7．2 干細(xì)胞制備方法
7．2．1 胚胎干細(xì)胞制備方法
7．2．2 成體干細(xì)胞制備方法
7．2．3 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞制備方法
7．2．4 腫瘤干細(xì)胞制備方法
7．3 干細(xì)胞研究進(jìn)展
7．3．1 胚胎干細(xì)胞研究進(jìn)展
7．3．2 成體干細(xì)胞研究進(jìn)展
7．3．3 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞研究進(jìn)展
7．4 干細(xì)胞臨床應(yīng)用
7．4．1 干細(xì)胞及其衍生產(chǎn)品上市情況
7．4．2 干細(xì)胞治療的困境和對(duì)策
8 植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)天然活性物質(zhì)
8．1 植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)天然活性物質(zhì)概述
8．1．1 植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)概念
8．1．2 植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)天然活性物質(zhì)特點(diǎn)
8．2 植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)天然活性物質(zhì)的關(guān)鍵技術(shù)
8．2．1 植物細(xì)胞系建立
8．2．2 高產(chǎn)細(xì)胞系選育
8．2．3 高產(chǎn)細(xì)胞系保存
8．2．4 植物細(xì)胞放大培養(yǎng)技術(shù)及工藝
8．2．5 產(chǎn)物分離純化
8．3 植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)天然活性物質(zhì)的調(diào)控
8．3．1 植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控
8．3．2 植物細(xì)胞響應(yīng)外界刺激積累次生代謝物合成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑
8．3．3 植物天然活性物質(zhì)合成的分子調(diào)控機(jī)制
8．4 植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)貴重藥物應(yīng)用實(shí)例
8．4．1 紫杉醇生物合成的代謝調(diào)控
8．4．2 人參皂苷生物合成和次生代謝調(diào)控
9 植物組織快速繁殖生產(chǎn)試管苗
9．1 植物快速繁殖的概述
9．1．1 植物快速繁殖的概念
9．1．2 植物快速繁殖的特點(diǎn)
9．2 植物脫毒培養(yǎng)技術(shù)
9．2．1 植物脫毒和快速繁殖的意義
9．2．2 植物脫毒培養(yǎng)的方法及原理
9．2．3 植物脫毒苗的鑒定
9．3 人工種子
9．3．1 人工種子的概念
9．3．2 人工種子各構(gòu)成部分的特點(diǎn)
9．3．3 人工種子的儲(chǔ)藏
……
10 植物細(xì)胞工程育種
11 動(dòng)物細(xì)胞工程制藥
12 胚胎移植與試管動(dòng)物
13 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及其應(yīng)用
（4）微核體的制備
秋水仙堿及其衍生物和長(zhǎng)春花堿等能干擾微管的形成，染色體就被停滯在有絲分裂中期。動(dòng)物細(xì)胞受秋水仙堿作用，形成了體積不同的多個(gè)微核，經(jīng)用細(xì)胞松弛素B把微核從細(xì)胞中分離出來(lái)，就叫作微核體，它只含有細(xì)胞中的少數(shù)染色體。使微核體與完整細(xì)胞融合，是進(jìn)行基因定位的重要方法。
制備微核體的時(shí)候，用0.1μg/mL秋水仙堿處理細(xì)胞（48h以上），細(xì)胞分裂就被控制在分裂中期，此時(shí)染色體運(yùn)動(dòng)終止，在單個(gè)染色體或染色體群的周緣重現(xiàn)核膜，形成了大小不同的多數(shù)微核，此時(shí)的細(xì)胞就叫微核化細(xì)胞。然后借細(xì)胞松弛素B與離心并用的脫核法使微核從細(xì)胞分離出來(lái)成為微核體。
（5）植物細(xì)胞核和無(wú)核原生質(zhì)體的制備
植物細(xì)胞外部有一層細(xì)胞壁，先要去掉這一障礙，就是首先制備原生質(zhì)體，然后把收集的原生質(zhì)體放在低滲溶液中（或蒸餾水中）使原生質(zhì)體破裂，但核膜完整保留，然后用密度梯度離心法收集細(xì)胞核。酵母菌細(xì)胞核的提取方法與此相同。要得到無(wú)核的原生質(zhì)體（不是碎片），采用與動(dòng)物細(xì)胞制備胞質(zhì)體相似的辦法，就是用細(xì)胞松弛素處理后的原生質(zhì)體，再進(jìn)行高速離心，此時(shí)原生質(zhì)體分為兩部分，即無(wú)核的原生質(zhì)體和微型原生質(zhì)體（核外仍有少量細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)膜）。經(jīng)純化可獲得純凈的無(wú)核原生質(zhì)體。應(yīng)用透射電鏡技術(shù)，揭示剛?cè)ズ瞬痪玫募?xì)胞為圓形，以后逐漸鋪展開(kāi)。去核細(xì)胞的一些細(xì)胞器的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、分布排列均與真核細(xì)胞相似，例如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系、高爾基體、多核糖體、溶酶體和中心粒以及微粒、微管等骨架系統(tǒng)和微小的胞飲泡等均呈正常分布。線粒體從去核的胞質(zhì)體中央部位重新分布于鋪展的胞質(zhì)區(qū)，它的運(yùn)動(dòng)十分活躍，膜上各酶系的分布及作用過(guò)程都照樣存在。觀察證明，去核細(xì)胞在一段時(shí)間內(nèi)，其胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器的超微結(jié)構(gòu)是正常的。因此，去核細(xì)胞質(zhì)體是深入研究細(xì)胞質(zhì)作用的重要材料。
6.1.3細(xì)胞器重組
細(xì)胞器重組，是將分離得到的細(xì)胞器在一定條件下重新組合，形成雜種細(xì)胞的過(guò)程。
細(xì)胞器重組主要有三種形式，即胞質(zhì)體與核體重組、微核體與細(xì)胞重組、胞質(zhì)體與細(xì)胞重組。
�。�1）胞質(zhì)體與核體重組
胞質(zhì)體與核體重組又稱為核轉(zhuǎn)移，是將一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞的胞質(zhì)體中，獲得雜種細(xì)胞的過(guò)程。
核轉(zhuǎn)移的方法主要有核質(zhì)融合法和顯微注射法。
�、俸速|(zhì)融合法核質(zhì)融合法是將獲得的胞質(zhì)體與核體混合，加入適宜的助融劑（如聚乙烯醇、仙臺(tái)病毒等），在一定條件下處理一定時(shí)間，使核體融合到胞質(zhì)體中，然后在一定條件下培養(yǎng)一定時(shí)間獲得雜種細(xì)胞的方法。其操作方法與原生質(zhì)體融合的方法基本相同。
�、陲@微注射法顯微注射法是通過(guò)特制的顯微注射器，將一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核吸出，再移入另一個(gè)去核細(xì)胞中的方法。這個(gè)方法已經(jīng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的核移植方面成功應(yīng)用，即首先將哺乳動(dòng)物的受精卵去核，制備得到胞質(zhì)體，通過(guò)顯微注射器將動(dòng)物體細(xì)胞的細(xì)胞核取出，轉(zhuǎn)移到去核受精卵中，再將接受了核轉(zhuǎn)移存活的受精卵移植入雌性動(dòng)物的子宮中發(fā)育成個(gè)體。用這個(gè)方法已經(jīng)成功地克隆了綿羊、牛、豬等動(dòng)物。
�。�2）微核體與細(xì)胞重組
微核體與細(xì)胞重組是將分離獲得的微核體與動(dòng)物細(xì)胞或植物、微生物原生質(zhì)體混合，加入適宜的助融劑，在一定條件下處理一段時(shí)間，使微核體進(jìn)入動(dòng)物細(xì)胞或植物、微生物的原生質(zhì)體中，以獲得雜種細(xì)胞。在前述的動(dòng)物細(xì)胞融合和原生質(zhì)體融合過(guò)程中，經(jīng)過(guò)融合獲得的含有兩種不同細(xì)胞核的異核體，要經(jīng)過(guò)體內(nèi)重組（核融合），才能獲得穩(wěn)定的融合子。
在雜種細(xì)胞分裂過(guò)程中，傾向于保留一個(gè)親本的全套染色體而排斥另一個(gè)親本的某些染色體。要得到穩(wěn)定的融合子，需要經(jīng)過(guò)相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間，同時(shí)保留下來(lái)的部分染色體也并非完整的染色體。通過(guò)微核體與細(xì)胞的融合，就可以在短時(shí)間內(nèi)把少量而又完整的染色體引入細(xì)胞，獲得穩(wěn)定的融合子。微核體與細(xì)胞融合的方法與前述動(dòng)物細(xì)胞融合和原生質(zhì)體融合的方法基本相同，在此不再贅述。
�。�3）胞質(zhì)體與細(xì)胞重組
胞質(zhì)體與細(xì)胞重組是將胞質(zhì)體與動(dòng)物細(xì)胞或者植物、微生物原生質(zhì)體混合，在助融劑的作用下，經(jīng)過(guò)膜融合和胞質(zhì)融合，獲得胞質(zhì)雜種細(xì)胞的技術(shù)過(guò)程。胞質(zhì)體與細(xì)胞重組雖然沒(méi)有改變親本細(xì)胞的細(xì)胞核，但是由于引入的胞質(zhì)體細(xì)胞質(zhì)中含有蛋白質(zhì)等物質(zhì)，也可能對(duì)細(xì)胞或者個(gè)體的特性產(chǎn)生影響。胞質(zhì)體與細(xì)胞或原生質(zhì)體的融合方法與原生質(zhì)體融合方法相同。經(jīng)過(guò)細(xì)胞器重組獲得的融合子還需經(jīng)過(guò)篩選。篩選融合子的方法主要有：利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記進(jìn)行篩選，利用抗藥性標(biāo)記進(jìn)行篩選，利用摻人熒光素標(biāo)記進(jìn)行篩選等。
細(xì)胞拆合技術(shù)是一種很有用的手段，就基礎(chǔ)研究而言，通過(guò)這種技術(shù)證明了細(xì)胞核的核酸合成方式和基因表達(dá)是受細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)的影響。例如小鼠淋巴細(xì)胞是不產(chǎn)生白蛋白的，用它和能分泌白蛋白的大鼠肝癌細(xì)胞融合，可以產(chǎn)生有特異功能的雜種細(xì)胞，既能生產(chǎn)大鼠白蛋白，也能產(chǎn)生小鼠白蛋白。細(xì)胞拆合技術(shù)已被用于動(dòng)物育種工作，童第周曾用核移植的方法育成鯉鯽核質(zhì)雜交魚，以選育新品種。
……
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