前言
白細(xì)胞介素18(Interleukine-18,IL-18)是一種多效細(xì)胞因子，具有強(qiáng)烈的IFN-誘生能力，對(duì)機(jī)體起著重要的免疫調(diào)節(jié)和保護(hù)作用，在抗微生物感染、抗腫瘤免疫中具有應(yīng)用潛力，因此IL-18可作為免疫佐劑與一些病原微生物的保護(hù)性基因共表達(dá)，從而加強(qiáng)疫苗的免疫效果或制備基因工程疫苗；由于雞IL-18(ChIL-18)基因發(fā)現(xiàn)較晚，而對(duì)人和哺乳動(dòng)物IL-18的研究已有許多報(bào)道，且其具有與人和哺乳動(dòng)物相似的生物學(xué)功能，因此ChIL-18在比較免疫學(xué)研究和禽病治療中具有重要意義。pFastBacTM Dual載體含有PH啟動(dòng)子和p10啟動(dòng)子，可以同時(shí)表達(dá)兩個(gè)具有獨(dú)立活性的外源蛋白。桿狀病毒對(duì)脊椎動(dòng)物無(wú)病原性，也不能在脊椎動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、表達(dá)，更不能把其基因整合到脊椎動(dòng)物細(xì)胞染色體內(nèi)，因此重組桿狀病毒可以被認(rèn)為遺傳學(xué)上安全的表達(dá)載體。外源基因因插入多角體蛋白基因的座位引起后者的缺失或滅活，因此重組病毒不產(chǎn)生包涵體，這不僅為重組病毒選擇提供了標(biāo)記，而且重組不能像野生型病毒那樣在環(huán)境中長(zhǎng)期存在，所以更安全。故本研究直接將未純化的雙表達(dá)蛋白進(jìn)行免疫原性研究。
傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是由IBD 病毒(IBDV)感染雛雞引起的以淋巴組織，特別是中樞免疫器官法氏囊為主要特征的高度接觸性傳染病。該病主要導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制，使機(jī)體的免疫能力降低和疫苗免疫接種失敗。雖然滅活疫苗和減毒活疫苗是相當(dāng)成熟的，但由于IBDV強(qiáng)毒株和抗原變異的出現(xiàn)使其免疫效價(jià)降低。VP2 是IBDV的主要保護(hù)性抗原，已經(jīng)鑒定的IBDV中和表位主要在VP2 上，并且多為構(gòu)象依賴性，這意味著VP2 的立體結(jié)構(gòu)對(duì)其中和表位的形成至關(guān)重要，與病毒中和抗體的誘導(dǎo)、抗原和毒力的變異以及細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)等有關(guān)。
禽流感(Avian influenza,AI)是由AI病毒(AIV)感染引起的一種高度接觸性人畜共患傳染病。HPAI 的暴發(fā)給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)了一定的經(jīng)濟(jì)損失，H5N1亞型AI的出現(xiàn)不僅產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)損失，還帶來(lái)了恐慌。AIV的主要抗原決定簇都位于HA1區(qū)域。體外表達(dá)HA1涵蓋了所有的HA空間中和表位，故其完全可以替代HA作為抗原。所以HA1蛋白是研制基因工程亞單位苗的理想候選抗原。
本試驗(yàn)利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，選用pFastBacTM Dual雙表達(dá)載體，在昆蟲(chóng)細(xì)胞中共表達(dá)mChIL-18基因蛋白和IBDV VP2基因蛋白或H5型AIV HA1基因蛋白，并對(duì)未純化蛋白生物學(xué)活性進(jìn)行分析；進(jìn)而研究未純化蛋白免疫原性。為進(jìn)一步研究VP2基因工程疫苗、HA1基因工程疫苗的免疫效果以及mChIL-18在IBD、AI的免疫調(diào)節(jié)作用等相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。
一、ChIL-18原核表達(dá)蛋白復(fù)性研究
研究利用不同的復(fù)性方法輔助rChIL-18原核表達(dá)蛋白的復(fù)性，以提高雞IL-18重組蛋白復(fù)性率，獲得更多具有良好活性的蛋白。將重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-mChIL-18轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞大腸桿菌BL21（DE3），并用IPTG于37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在。包涵體經(jīng)超聲波破碎、洗滌后以6mol/L的鹽酸胍溶解，使蛋白徹底變性,然后利用鹽酸胍-去離子水透析法、鹽酸胍-谷胱甘肽變性復(fù)性法和人工分子伴侶系統(tǒng)法分別輔助蛋白復(fù)性。復(fù)性產(chǎn)物經(jīng)透析純化后，利用淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)其活性。經(jīng)SDS-PAGE分析表明,表達(dá)產(chǎn)物是與ChIL-18重組蛋白相符的Mr約44000的蛋白條帶。利用人工分子伴侶系統(tǒng)輔助復(fù)性的方法獲得的復(fù)性率最高，復(fù)性率為42��54％。雞淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)表明,表達(dá)產(chǎn)物對(duì)雞淋巴細(xì)胞具有明顯誘導(dǎo)增殖作用。上述試驗(yàn)顯示，人工分子伴侶系統(tǒng)能夠較好地輔助雞IL-18重組蛋白復(fù)性，獲得較高的復(fù)性率。其產(chǎn)物具有良好的生物學(xué)活性,為下一步雞IL-18重組蛋白的應(yīng)用研究奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)。
將重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-mChIL-18轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞大腸桿菌BL21（DE3），并用IPTG于37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得表達(dá)。表達(dá)的包涵體經(jīng)超聲波破碎、洗滌后以6mol/L的鹽酸胍溶解，使蛋白徹底變性。然后按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察不同濃度組成的人工分子伴侶體系對(duì)不同濃度雞IL-18重組蛋白復(fù)性率的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，利用人工分子伴侶系統(tǒng)輔助雞IL-18重組蛋白的復(fù)性存在最佳的條件，優(yōu)化該條件能夠提高該融合蛋白的復(fù)性率，且產(chǎn)物都具有良好的生物學(xué)活性，為雞IL-18重組蛋白的進(jìn)一步應(yīng)用研究奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)。
二、雞IL-18原核表達(dá)蛋白及真核表達(dá)質(zhì)粒對(duì)IBDV滅活疫苗免疫增強(qiáng)作用的研究本研究室在2001年開(kāi)展雞白細(xì)胞介素18（ChIL-18）的研究，先后構(gòu)建ChIL-18的重組質(zhì)粒和原核表達(dá)系統(tǒng)、真核質(zhì)粒及其表達(dá)系統(tǒng)，在此基礎(chǔ)上，對(duì)純化后的原核表達(dá)的重組雞白細(xì)胞介素18產(chǎn)物進(jìn)行生物學(xué)活性檢測(cè)，對(duì)其在生產(chǎn)中的應(yīng)用做了初步研究，同時(shí)對(duì)影響ChIL-18原核表達(dá)產(chǎn)物生物學(xué)活性的因素也進(jìn)行了探討。將雞IL-18原核表達(dá)蛋白的復(fù)性產(chǎn)物和真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3��1TOPO-mChlL18分別與IBDV滅活疫苗聯(lián)合應(yīng)用，通過(guò)中和抗體檢測(cè)和T淋巴細(xì)胞對(duì)ConA增殖反應(yīng)試驗(yàn)，研究其對(duì)IBDV滅活疫苗的免疫增強(qiáng)作用。結(jié)果顯示，在接種后第21、28、35及42天時(shí)蛋白組和質(zhì)粒組與單純疫苗組抗體水平差異顯著（P<0��05）,且蛋白組比質(zhì)粒組效果更明顯一些；其T淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)也強(qiáng)于單純疫苗組，尤其是在免疫14天后增殖效果明顯高于單純疫苗組（P<0��05）。接種42d后進(jìn)行攻毒保護(hù)性試驗(yàn)，結(jié)果表明：同時(shí)接種雞IL-18原核表達(dá)蛋白復(fù)性產(chǎn)物和真核表達(dá)質(zhì)粒的試驗(yàn)組雞獲得93��3％的保護(hù)率，而單純疫苗接種組的保護(hù)率為73��3％。雞IL-18的原核表達(dá)蛋白和真核表達(dá)質(zhì)粒均具有明顯的增強(qiáng)IBD滅活疫苗免疫效果的作用。
三、mChIL-18與VP2或HA1在桿狀病毒表達(dá)載體中的共表達(dá)
分別以pMD18-T-VP2、pMD18-T-HA1和pMD18-T-mChIL18質(zhì)粒為模板，以桿狀病毒pFastBacTM Dual為載體，將mChIL18基因與VP2基因或HA1基因分別插入到載體的PH啟動(dòng)子和P10啟動(dòng)子的下游，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pF-IL18、pF-VP2、pF-IL18-VP2、pF-HA1、pF-IL18-HA1。將其轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)三重抗性(含卡那霉素、慶大霉素和四環(huán)素)與藍(lán)白斑篩選，用小量法提取重組桿狀病毒質(zhì)粒rBac-IL18、rBac-VP2、rBac-IL18-VP2、rBac-HA1、rBac-IL18-HA1，通過(guò)一對(duì)通用引物M13(Bacmid含有該引物Forward和Reverse兩個(gè)引物位點(diǎn)，能夠從兩側(cè)擴(kuò)增LacZ互補(bǔ)區(qū)域內(nèi)的mini-attTn7位點(diǎn)，有利于PCR分析)進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。在轉(zhuǎn)染試劑Cellfectin II的作用下，通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)法將純化的rBac-IL18、rBac-VP2、rBac-IL18-VP2、rBac-HA1、rBac-IL18-HA1轉(zhuǎn)染至草地貪夜蛾細(xì)胞(Spodoptera frugiperda 9，sf9)獲得P1代重組桿狀病毒，用P1代病毒感染sf9來(lái)擴(kuò)增病毒滴度，將達(dá)到一定滴度(107～108pfu/mL)的P3代重組桿狀病毒感染sf9，感染72h后收獲sf9細(xì)胞及培養(yǎng)上清，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測(cè)和間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)檢測(cè)。SDS-PAGE檢測(cè)顯示，mChIL-18、VP2、HA1基因均在sf9中的裂解上清中得到了高效表達(dá)，即表達(dá)的蛋白是可溶性的，表達(dá)的目的條帶分子量分別約為19��5 KD,48��4 KD,37��4 KD。IFA檢測(cè)顯示mChIL18基因與VP2基因或HA1基因分別同時(shí)在同一細(xì)胞中獨(dú)立表達(dá)。
四、雙表達(dá)產(chǎn)物pF-IL18-VP2和pF-IL18-HA1的生物學(xué)活性檢測(cè)
采用雞脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)(MTT法)、IFN-誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)和水皰性口炎病毒(VSV)抑制試驗(yàn)對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行生物學(xué)活性測(cè)定。雞脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)表明，不同濃度的pIL18、pVP2-IL18 和pHA1-IL18均能夠明顯促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖，隨著蛋白濃度的增加刺激轉(zhuǎn)化作用逐漸增強(qiáng)，均當(dāng)濃度為200ng/mL時(shí)，刺激轉(zhuǎn)化效果最佳，增殖指數(shù)可達(dá)4��13、4��35、4��09，但隨著蛋白濃度的增大淋巴細(xì)胞的增殖指數(shù)逐漸降低。VSV病毒活性抑制試驗(yàn)表明，當(dāng)?shù)鞍诐舛却笥?00ng/mL時(shí)能刺激脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN-，并且隨著pIL18、pVP2-IL18 和pHA1-IL18濃度的增加誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-的量隨之增加；將不同稀釋度的IFN-分別作用于VSV，在IFN-1102U/mL時(shí)，具有較強(qiáng)的抑制效果，當(dāng)IFN-為10 U/mL時(shí)，只能達(dá)到約50%的保護(hù)。該結(jié)果說(shuō)明pIL18、pVP2-IL18 和pHA1-IL18的抗病毒活性是通過(guò)IFN-實(shí)現(xiàn)的，且在一定濃度范圍內(nèi)具有抑制VSV病毒產(chǎn)生細(xì)胞病變的作用。
五、雙表達(dá)蛋白pF-IL18-VP2和pF-IL18-HA1的免疫原性研究將含有pIL18、pVP2、pVP2-IL18的油乳劑疫苗分組免疫動(dòng)物，14d時(shí)一免，28d時(shí)二免。Ⅰ組為傳統(tǒng)疫苗組；Ⅱ組為pIL18與B78減毒疫苗聯(lián)合疫苗組；Ⅲ為pIL18與pVP2聯(lián)合疫苗組；Ⅳ組為pVP2-IL18單獨(dú)免疫組；Ⅴ組一免注射B78減毒疫苗，二免注射pVP2-IL18；Ⅵ組為pVP2單獨(dú)免疫組；Ⅶ組為對(duì)照組。從體液免疫和細(xì)胞免疫水平上分析試驗(yàn)結(jié)果。細(xì)胞免疫水平通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，從統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上分析處理數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，與免疫前和陰性對(duì)照組相比，各試驗(yàn)組都促進(jìn)CD4 和CD8 T細(xì)胞增殖。一免后各試驗(yàn)組CD4 T細(xì)胞都呈上升趨勢(shì)，但一免7d后又呈下降趨勢(shì)；二免后Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ呈上升趨勢(shì)且持續(xù)時(shí)間比較長(zhǎng)，其中Ⅳ組CD4 T增殖水平最高，在一免后21d、28d、35d都與其他組差異顯著(P<0��05)。一免后各試驗(yàn)組CD8 T細(xì)胞都呈上升趨勢(shì)，但一免7d后又呈下降趨勢(shì)；二免后各實(shí)驗(yàn)組仍呈不同下降趨勢(shì)，其中Ⅰ組CD8 T增殖水平最高，在一免后14d、21d、28d都與其他組差異顯著(P<0��05)。體液免疫水平通過(guò)使用傳染性法氏囊病病毒抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，從統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上分析處理數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，與免疫前相比，各試驗(yàn)組都有較好的促進(jìn)IBD抗體生成作用，抗體水平都持續(xù)增高且維持時(shí)間也較長(zhǎng)，都在在一免后28d抗體水平達(dá)到最高；與陰性對(duì)照組相比，Ⅳ組效果最好，抗體效價(jià)最高，Ⅴ組次之,然后是Ⅱ組、Ⅰ組、Ⅲ組、Ⅵ組。攻毒試驗(yàn)結(jié)果表明，Ⅳ組保護(hù)率可達(dá)90%，Ⅴ組次之可達(dá)80%，然后是Ⅰ組和Ⅱ組75%、Ⅲ組為70%、Ⅵ組50%，Ⅶ組無(wú)一幸免。
將含有pIL18、pHA1、pHA1-IL18的油乳劑疫苗分組免疫動(dòng)物，7d時(shí)一免，21d時(shí)二免。Ⅰ組為傳統(tǒng)疫苗組；Ⅱ組為pIL18與傳統(tǒng)疫苗聯(lián)合疫苗組；Ⅲ為pHA1單獨(dú)免疫組；Ⅳ組為pHA1-IL18單獨(dú)免疫組；Ⅴ組pIL18與pHA1聯(lián)合疫苗組；Ⅵ組為pHA1單獨(dú)免疫組；Ⅶ組為對(duì)照組。從體液免疫和細(xì)胞免疫水平上分析試驗(yàn)結(jié)果。細(xì)胞免疫水平通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。結(jié)果表明，與免疫前和陰性對(duì)照組相比，各試驗(yàn)組都能夠明顯促進(jìn)CD4 和CD8 T細(xì)胞的增殖反應(yīng)：一免后各試驗(yàn)組CD4 和CD8 T細(xì)胞都呈上升趨勢(shì)，但一免7d后又呈下降趨勢(shì)；二免后雖呈上升趨勢(shì)且持續(xù)時(shí)間比較長(zhǎng)，但增殖幅度不大，以Ⅳ組CD4 T增殖水平最高。體液免疫水平通過(guò)使用血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)。結(jié)果表明，各試驗(yàn)組都有較好的促進(jìn)ND、H5型AI和H9型AI抗體生成作用，都是在一免后28d抗體水平達(dá)到最高；與陰性對(duì)照組相比，Ⅳ組效果最好，抗體效價(jià)最高與其他組差異顯著(P<0��05)。


著者2019年3月