實(shí)習(xí)一 組織學(xué)緒論
學(xué)習(xí)要點(diǎn)
掌握：顯微鏡的結(jié)構(gòu)及其使用方法。
了解：石蠟切片、HE染色標(biāo)本制作過程。
組織學(xué)是研究正常人體的微細(xì)結(jié)構(gòu)及其相關(guān)功能的科學(xué),主要研究工具是顯微鏡。組織學(xué)實(shí)訓(xùn)課是通過正確而熟練地在鏡下識(shí)別主要器官的結(jié)構(gòu)及其基本組織和細(xì)胞成分,描述標(biāo)本組織切片的特點(diǎn),驗(yàn)證課堂講授的理論知識(shí),使理論與實(shí)際相結(jié)合的課程。通過實(shí)訓(xùn)課的直接觀察,加強(qiáng)形態(tài)學(xué)描述和描繪技能訓(xùn)練,培養(yǎng)分析問題和解決問題的能力,加深對(duì)理論知識(shí)的理解,牢固地掌握組織學(xué)基本知識(shí)。
一、顯微鏡的結(jié)構(gòu)及使用
顯微鏡是醫(yī)學(xué)科學(xué)中常用的貴重精密光學(xué)儀器之一,是組織學(xué)實(shí)習(xí)的主要工具。在使用過程中應(yīng)對(duì)同學(xué)作如下的要求： ① 熟悉顯微鏡各部分的性能和用途,仔細(xì)小心,養(yǎng)成正規(guī)操作的習(xí)慣；② 掌握顯微鏡觀察和分析組織標(biāo)本的技能；③ 自覺遵守顯微鏡管理和使用制度,嚴(yán)防損壞。
（一） 顯微鏡的主要結(jié)構(gòu)
1. 機(jī)械裝置部分鏡體、目鏡筒、載物臺(tái)、標(biāo)本夾、標(biāo)本移動(dòng)器、物鏡轉(zhuǎn)換器、粗調(diào)節(jié)螺旋、細(xì)調(diào)節(jié)螺旋、屈光度調(diào)節(jié)環(huán)、孔徑光闌調(diào)節(jié)桿、電源開關(guān)、亮度調(diào)節(jié)鈕、聚光器升降桿。
圖11顯微鏡的結(jié)構(gòu)
2. 光學(xué)系統(tǒng)部分目鏡（放大倍數(shù)為8×或10×）、物鏡（包括放大鏡×4、低倍鏡×10、高倍鏡×40、油鏡×100）、聚光器、光源。
請(qǐng)根據(jù)圖示熟悉顯微鏡的結(jié)構(gòu),并熟練掌握使用方法。
（二） 顯微鏡的使用方法
1. 取放自鏡箱中取出或放入顯微鏡時(shí),應(yīng)以右手握住鏡臂,左手托鏡座,使鏡身保持平穩(wěn)。拿顯微鏡時(shí),要輕拿輕放,嚴(yán)禁鏡身傾斜,前后搖擺,致使目鏡或反光鏡脫落損毀,以免碰壞顯微鏡。
2. 使用前后均要進(jìn)行檢查經(jīng)常保持顯微鏡的清潔,顯微鏡上的各種配件不可任意取下或拆開,如有損壞要及時(shí)報(bào)告并登記,以便處理與修復(fù)。如有油脂沾污,可沾少許二甲苯輕擦。切勿用手或手帕和其他紙張擦光學(xué)部分,以免磨損。
3. 電源打開電源開關(guān),適當(dāng)調(diào)整電壓（或光線亮度）。
4. 對(duì)光轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器,對(duì)正低倍物鏡,肉眼從鏡側(cè)注視,轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)螺旋使接物鏡距載物臺(tái)平面5mm左右。眼睛從目鏡觀察,適當(dāng)調(diào)整光亮,整個(gè)視野均勻?yàn)闇?zhǔn)。從雙筒顯微鏡的目鏡中觀看時(shí),應(yīng)根據(jù)個(gè)人的眼距不同,調(diào)節(jié)兩目鏡之間的距離,使兩個(gè)視野重合為一個(gè)大的視野。
5. 標(biāo)本放置和視野調(diào)整將標(biāo)本用卡片器固定好,調(diào)整切片位置使標(biāo)本對(duì)準(zhǔn)聚光中心,以便觀察。以左手調(diào)節(jié)粗細(xì)螺旋,右手移動(dòng)推進(jìn)器。如視野偏暗、明暗不勻或模糊時(shí),可從以下幾方面檢查并作適當(dāng)處理： ① 物鏡是否對(duì)正？② 聚光器光圈開得大小如何？③ 聚光器的高低如何？④ 目鏡、物鏡、聚光器的集光鏡是否沾污？
6. 觀察完畢將標(biāo)本取下,按編號(hào)順序放入標(biāo)本盒內(nèi)。關(guān)閉電源開關(guān),注意程序是： ① 將光源關(guān)至最�。虎� 關(guān)掉電源開關(guān)；③ 拔掉插頭。
（三）正確地進(jìn)行標(biāo)本觀察
觀察標(biāo)本時(shí)要明確本次實(shí)習(xí)的目的與要求,按照實(shí)習(xí)指導(dǎo)進(jìn)行。首先了解標(biāo)本的名稱、取材部位、制片方法、切片方位及染色方法,然后按照肉眼觀察、低倍鏡觀察和高倍鏡觀察的順序進(jìn)行系統(tǒng)觀察標(biāo)本。
特別需要指出的是： 應(yīng)重視低倍鏡下的觀察,了解組織切片的全貌、層次、部位關(guān)系,有許多標(biāo)本,在低倍鏡下即可達(dá)到觀察的主要目的。而高倍鏡下觀察的只是局部結(jié)構(gòu)的放大。切勿放置標(biāo)本后立即用高倍鏡觀察或?qū)ふ夷繕?biāo),這樣會(huì)迷失方位,限制視野,混淆層次,建立不起整體概念,以致觀察結(jié)果不全面、不準(zhǔn)確,甚至錯(cuò)誤。這是一般初學(xué)者易犯的毛病,希望引起高度重視。
1. 肉眼觀察對(duì)著白色背景用肉眼觀察標(biāo)本的大小、形狀、顏色及取材方位。
2. 低倍鏡觀察取標(biāo)本,擦凈,使蓋玻片朝上而載玻片在下,放在載物臺(tái)上,用卡片器夾好,并用推進(jìn)器將標(biāo)本移到載物臺(tái)通光孔正中。轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器,將低倍物鏡（×4或×10）對(duì)準(zhǔn)標(biāo)本,慢慢旋轉(zhuǎn)粗螺旋,鏡頭下降至近玻片,從目鏡觀察,同時(shí)慢慢轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)螺旋,使物鏡緩緩上升,調(diào)節(jié)焦點(diǎn)距離,直至看到清晰的物像為止。觀察標(biāo)本時(shí),如果光線太強(qiáng),或標(biāo)本染色太淺,透明度較大,可將光調(diào)暗；反之,如果光線太暗或標(biāo)本染色很深,應(yīng)將光學(xué)調(diào)亮�？傊�,要使光亮適宜觀察。
3. 高倍鏡觀察目的是對(duì)某些部位的結(jié)構(gòu)進(jìn)一步放大觀察,以了解其微細(xì)構(gòu)造,是在完成低倍鏡觀察要求的前提下進(jìn)行的。先將選好需要觀察的部位移至視野正中,然后轉(zhuǎn)換高倍鏡（×40）,進(jìn)行觀察,應(yīng)用細(xì)螺旋調(diào)節(jié)焦距,看到清晰物像。注意不要用粗螺旋調(diào)節(jié)焦距壓碎玻片,甚至將鏡頭損壞。達(dá)到高倍鏡觀察目的后,還可再用低倍鏡觀察,這樣低倍、高倍鏡反復(fù)使用,使一般與特殊緊密結(jié)合。
4. 油鏡觀察實(shí)習(xí)課中僅在觀察血液和骨髓涂片時(shí)需要使用。也應(yīng)遵循肉眼、低倍、高倍的順序進(jìn)行初步觀察。將選好的觀察部位移至視野中央,先提高鏡筒,轉(zhuǎn)換油鏡頭（×100）,再在標(biāo)本上滴一滴鏡油,小心地將鏡筒下降,同時(shí)肉眼看著將鏡頭浸入油內(nèi),并可使之與標(biāo)本輕微接觸。然后一方面用眼睛自目鏡觀察,一方面慢慢轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)螺旋使鏡筒微微上升,直到看清物象后,再用細(xì)螺旋繼續(xù)調(diào)節(jié),進(jìn)行觀察。注意,切不可用下降鏡筒的辦法對(duì)焦點(diǎn),這樣是容易損壞標(biāo)本的。
注意： 應(yīng)用鏡油的時(shí)候,切不可將鏡油接觸到高倍鏡和低倍鏡的鏡頭,否則的話,將造成應(yīng)用高倍鏡和低倍鏡觀察模糊,影響學(xué)習(xí)。實(shí)習(xí)完畢后,先用擦鏡紙擦凈物鏡上的油,再換一張紙,滴少許二甲苯輕輕擦凈鏡面上的油跡,再換一張擦鏡紙擦去二甲苯。標(biāo)本上的油跡也用此法清除。
（四） 觀察標(biāo)本時(shí)應(yīng)注意的事項(xiàng)
1. 注意標(biāo)本的平面與立體的關(guān)系人體結(jié)構(gòu)極為復(fù)雜,就同一個(gè)器官或細(xì)胞來說,它是一個(gè)立體結(jié)構(gòu),圖12雞蛋的各種切面
但切片標(biāo)本所觀察的圖像是平面的,所切的部位不同或者所切的方向不同,則切片所顯示的物像就不相同。因此在觀察時(shí),要建立起立體概念。例如,我們將一個(gè)細(xì)胞用一個(gè)雞蛋表示,通過不同方向和部位所作的各種切面,則可得到不同的物像,如圖12所示。若對(duì)呈輻射狀排列的細(xì)胞群體作各種切面,其各種物像如圖13所示。若對(duì)呈管狀的器官作各種切面,其形狀如圖14、15所示；若對(duì)呈束狀的器官作各種切面,其形狀如圖16所示。
2. 注意標(biāo)本的不同生理動(dòng)態(tài)變化機(jī)體在不同生理情況下,同一組織結(jié)構(gòu)是有改變的,如腺體在分泌過程中,其細(xì)胞構(gòu)造就不斷地發(fā)生著變化。所以,在觀察時(shí)要有一個(gè)動(dòng)態(tài)的觀點(diǎn)。
圖13輻射狀排列的細(xì)胞群的各種切面
圖14弓形管狀結(jié)構(gòu)的各種切面
圖15管狀器官的各種切面
圖16束形器官的各種切面
3. 注意標(biāo)本的多種染色方式的綜合運(yùn)用我們所觀察的標(biāo)本是死組織,是經(jīng)過復(fù)雜的技術(shù)過程制成的,而且一張標(biāo)本只能用某一種染色方法制作。因此,它不能夠顯示出組織、細(xì)胞所有的結(jié)構(gòu)。所以,在實(shí)習(xí)過程中還要觀察一些示教材料如特殊染色等,以補(bǔ)不足。同時(shí)要將這些不同的材料、標(biāo)本進(jìn)行綜合分析,使認(rèn)識(shí)更加全面與深刻。
4. 注意標(biāo)本中的人為現(xiàn)象由于制片技術(shù)上的原因,有時(shí)在標(biāo)本中會(huì)出現(xiàn)一些人為缺陷,并非組織結(jié)構(gòu),應(yīng)予鑒別。包括以下幾種： ① 刀痕： 因切片刀鋒有缺口造成組織標(biāo)本縱行刀痕。② 裂紋： 組織透明、浸蠟的時(shí)間過長(zhǎng),組織脆硬,切片時(shí)可引起組織裂開,呈不規(guī)則裂紋。在制片過程中,由于組織或細(xì)胞各部分結(jié)構(gòu)的收縮不一致,或貼片時(shí)水溫過高,也可導(dǎo)致某些人為裂隙。③ 皺褶： 貼片時(shí)組織未充分展平或標(biāo)本鋪得不平整而發(fā)生皺褶。④ 氣泡： 封片時(shí)將少許空氣封入切片樹膠中。⑤ 遺留物： 如染色時(shí)殘留的染料沉渣或固定液化學(xué)物質(zhì)沒有除凈而出現(xiàn)的沉淀物等。
（五） 觀察記錄與繪圖
組織學(xué)實(shí)習(xí)的觀察記錄主要是繪圖描記所見,它可以幫助理解與記憶。繪圖時(shí)要突出主要內(nèi)容,力求準(zhǔn)確地表現(xiàn)出組織結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)及其相互關(guān)系。繪圖可用有色鉛筆,注字用普通鉛筆。繪圖要求比例適當(dāng),描繪準(zhǔn)確,注字工整,以養(yǎng)成嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度。
二、 組織學(xué)標(biāo)本制作的基本過程與原理
1. 目的： 了解組織學(xué)標(biāo)本制作的程序和各步驟的作用。
2. 標(biāo)本制作要求： ① 盡可能保存組織生前結(jié)構(gòu)；② 標(biāo)本要透明,可容顯微鏡下的光線通過；③ 不同的結(jié)構(gòu)在顯微鏡下必須能顯出不同影像；④ 標(biāo)本可長(zhǎng)期保存以供長(zhǎng)期觀察。
組織學(xué)的研究方法很多,但概括起來可分為兩類：
（1） 活體觀察： 即觀察細(xì)胞、組織或器官在生活時(shí)的形態(tài)結(jié)構(gòu),不易長(zhǎng)期保存,而且有許多結(jié)構(gòu)不能看到。在組織學(xué)實(shí)訓(xùn)課中一般不用這種方法的。
（2） 死后觀察： 即從致死或近死的機(jī)體中取出組織或器官,經(jīng)過標(biāo)本固定等技術(shù)處理、制成標(biāo)本,觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu),并根據(jù)形態(tài)變化推測(cè)生活時(shí)的狀態(tài)。該方法的優(yōu)點(diǎn)是可以顯示出各種不同變化經(jīng)過的成分,所制標(biāo)本又能長(zhǎng)期保存,反復(fù)觀察。在實(shí)訓(xùn)中所觀察的都是這類標(biāo)本。
普通常用的組織標(biāo)本制作過程及其基本原理簡(jiǎn)介如下：
石蠟包埋切片標(biāo)本制作法
石蠟包埋切片、蘇木精伊紅染色法是最常用的組織學(xué)標(biāo)本制作方法,包括以下幾個(gè)步驟： 取材、固定、水洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、貼片、染色、脫水、透明和封固。
1. 取材、固定
（1） 取材： 即從動(dòng)物體內(nèi)取下某一器官或組織材料的過程,大小約0.5cm3為宜,盡量保證為新鮮組織材料。材料的來源一般是來自尸檢或取自實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。因此,動(dòng)物在麻醉下或以不同方法致死后,應(yīng)立即進(jìn)行取材,操作宜細(xì)致迅速,要盡量減少細(xì)胞、組織在機(jī)體死后的改變和避免對(duì)組織的機(jī)械損傷。組織在動(dòng)物死后或離體后會(huì)很快解體,原因可能是由于細(xì)菌或是組織本身所含酶的分解所致。取材后要立即進(jìn)行固定,以停止其分解作用,盡可能保存細(xì)胞組織生前結(jié)構(gòu)和成分。
（2） 固定： 固定作用是一種化學(xué)及物理過程,使其蛋白質(zhì)等成分迅速凝固,其目的是為防止組織的自溶和細(xì)菌的侵入,使組織固定硬化,以保持其在取材時(shí)的形態(tài)結(jié)構(gòu)。固定時(shí)所使用的化學(xué)溶液,稱為固定液。
常用的固定劑有： ① 單純固定劑： 即用單一的化學(xué)物質(zhì)配制成的固定液。如乙醇、甲醛、乙酸、鋨酸等。② 混合固定劑： 用數(shù)種化學(xué)物質(zhì)配制成的固定液。一般來講,采用混合固定液較好,但固定液的選擇,以組織的種類不同和顯示組織組成成分的目的需求不同而異。常用的固定液配方：
Ⅰ. Susa液： Ⅰ液氯化汞（升汞）飽和水溶液 50.0mlⅡ液氯化鈉 0.5g三氯乙酸 2.0g冰醋酸 4.0ml甲醛（40％） 20.0ml蒸餾水 30.0ml 使用時(shí)取等量的Ⅰ液和Ⅱ液混合后,將組織塊投入,固定24h。
Ⅱ. Helly干液： 重鉻酸鉀 2.5g氯化汞 5.0g硫酸鈉 1.0g蒸餾水 100.0ml 使用之前加入40％甲醛5.0ml。
Ⅲ. 10％甲醛： 甲醛 10.0ml蒸餾水 90.0ml Ⅳ. Bouin液： 苦味酸飽和水溶液 75.0ml40%甲醛 25.0ml冰醋酸 5.0ml